（北京市第三十五中学，北京 100035）
抗生素是一种能够杀死或者抑制细菌生长的药物。常用的抗生素包括: β-内酰胺类，氨基糖苷类，利福霉素类和四环素类。抗生素虽能有效抑菌或杀菌，但其滥用也会造成很多负面作用。抗生素的滥用不仅会导致超级耐药菌产生，也会对大脑功能产生损害。混合抗生素会降低小鼠新生神经元的数量并影响小鼠记忆功能。向发育期的Sprague Dawley (SD)鼠腹腔注射青霉素会损伤学习记忆功能。利福平被认为能在急性脑梗中保护神经元。多西环素能显著地减弱恐惧记忆的遗忘速度。腹腔注射庆大霉素会导致小鼠下丘核中的神经营养因子(Neurotrophin-3,NT-3)表达量显著性降低，该结果被认为是解释庆大霉素导致耳中毒(Ototoxicity)的原因。认知功能包括很多方面，例如学习功能，记忆功能还有记忆灵活性，而抗生素对多种认知功能的作用评价鲜有报道。果蝇作为一种模式生物被广泛的应用于认知功能机理探索。
本研究将利用果蝇探索了临床常用但属于不同类型的四种抗生素(青霉素钾、庆大霉素、利福平和盐酸多西环素)对嗅觉学习能力、记忆能力和认知灵活性的影响并对分子机理进行初步探索，为进一步认识不同抗生素对认识功能的影响提供线索。
1 材料与方法
1.1 果蝇品系
本研究采用白眼、直翅的野生型w(isoCJ1)作为动物模型。所有测试果蝇的均饲养在恒温24℃, 恒湿42% RH的蝇房中，并保持12小时/12小时昼夜控制，保证果蝇正常节律。1.2 抗生素配制与给药
四种抗生素均避光室温保存。在给药当天，分别秤取125mg或250mg抗生素用于配制低和高浓度实验药物溶液。4%蔗糖溶液(含0.5% Tween80)作为溶媒。给药方式是将药液滴加到塑料管中的滤纸上，果蝇通过吮吸滤纸上药液给药。本实验中分别用KS1、KS2、KS3、KS4代表青霉素钾、利福平、盐酸多西环素和庆大霉素。
图1 高浓度给药下果蝇寿命曲线
图2 低浓度给药下果蝇寿命曲线
图3 学习能力，记忆能力和认知灵活性测试范式
图4 果蝇学习能力测试
图5 果蝇记忆能力测试
1.3 果蝇嗅觉学习和记忆测试方法
将约100只果蝇装入带有导电铜网的训练管，按照先后顺序通入3-octanol(OCT)和4-methylcyclohexanol (MCH)两种不同的气味，在通第一个气味(CS+)时，训练管的铜网通电(US)，果蝇被电击；当通第二个气味时(CS-)，铜网不通电。该过程称为训练。在学习能力、1小时记忆能力和记忆灵活性评价测试中，训练后的果蝇分别在训练后5分钟、60分钟以及两个连续训练之后的5分钟后被迅速导入T-maze中。T-maze的两端分别同时通入OCT和MCH，果蝇对两种气味进行选择。果蝇行为指数是用选对(CS+)的果蝇的数量减去选错果蝇(选CS-)的数量，除以两者总果蝇数量并乘以100%。
图6 果蝇认知灵活性测试
图7 气味分辨能力测试
图8 生化检测KS1和KS4对PKC和Rac影响
1.4 果蝇气味辨别测试训练
将没有经过伴随电击训练的果蝇直接放入T-maze中，一侧通入空气，另一侧通入OCT或MCH气体。根据给药组与对照组果蝇选择空气端的数量计算出行为，并依据行为指数判断果蝇辨别气味的能力是否因给药而受到损伤。1.5 蛋白印记实验
给药后24小时的果蝇(每组约600只)收集并放入液氮20秒，之后取出震荡过筛收集果蝇头部。之后加入裂解液并进行研磨。研磨液经过12000rpm 4℃离心20分钟，上清液保存在-20℃。配制15%的SDSPAGE胶，并进行标准蛋白印记实验。抗体信息：Anti-Actin (1:8000)购自拜尔迪，PKC(1:2000)和磷酸化PKC(1:4000)购自BD, Rac1总蛋白(1:4000)购自Cytoskeleton LLC, PAK-beads购自Cytoskeleton LLC。激活的Rac1 (Rac1-GTP)检测采用之前报道方法。二抗分别采用Mouse-HRP和Rabbit-HRP(购自拜尔迪)，ECL发光液购自Millipore。条带分析采用Image-J，数据分析采用GraphPad Prism 6版本。1.6 数据统计
本实验中的分析采用student’s T-test，*代表p＜0.05，**代表p＜0.01，***代表p＜0.001。n.s代表无统计学差异。
图9 KS1和KS4对PKC磷酸化水平影响
图10 KS1和KS4对Rac激活水平影响
2 结果
2.1 125mg/mL是最佳给药浓度和给药24小时是最佳给药时间
为模拟抗生素过量所导致的影响。在不影响果蝇寿命的前提下，我们给予果蝇足量的药量以及足够长的药物暴露时间。因此，首先探索高浓度药液(250mg/mL)对果蝇寿命的影响。结果如图1所示，高浓度(250mg/mL)组中，所有果蝇在给药后4小时均未出现死亡。给药24小时之后，对照组(Ctrl)中95%的果蝇存活，KS1-KS4组的存活率分别是75%，100%，100%和75%。给药48小时后，对照组中75%的果蝇存活，KS1-KS4组的存活率分别是30%，95%，25%和10%。说明果蝇在长时间(＞24小时)摄取高剂量抗生素对寿命有影响，而短期(4小时) 给药没有影响。为了让果蝇有较长的药物暴露时间，我们又进行低浓度药液对果蝇寿命影响的实验。在低浓度(125mg/mL)给药实验中，结果如图2所示，所有实验组在给药后4小时均未出现果蝇死亡，在给药24小时之后，仅对照组果蝇出现5%数量死亡，所有抗生素组均未出现果蝇死亡。在给药48小时之后，对照组有75%的果蝇存活，KS1-KS4组的存活率分别是40%，95%，80%和15%。因此后续实验采用125mg/mL浓度作为实验浓度，24小时作为给药时长，原因是在该浓度和该给药时间内，所有果蝇均摄取了抗生素溶液并且无明显寿命影响。2.2 四种抗生素对果蝇学习能力的影响
本研究首先检测了果蝇在给药24小时(125mg/mL)浓度下，对于嗅觉学习能力的影响。行为范式如图3C1所示，结果如图4所示，健康对照组(Ctrl)的学习行为指数是78，而KS1-KS4的学习行为指数分别是69，79，70和59。经过统计分析发现KS4与健康对照组相比，学习能力显著性下降(p=0.0048)，而其他抗生素均不对果蝇嗅觉学习能力产生影响。2.3 四种抗生素对果蝇1小时记忆能力的影响
记忆能力测试行为范式如图3中C2所示，实验结果如图5所示，健康对照组(Ctrl)的60分钟记忆指数是55，而KS1-KS4的学习指数分别是75，65，57和58。经过统计分析发现KS1与健康对照组相比，1小时记忆能力显著性增强(p=0.0035)，而其他抗生素均不对果蝇嗅觉记忆能力产生影响。2.4 四种抗生素对果蝇认知灵活性的影响
记忆的灵活性是认知功能的重要指标，多种自闭症相关基因突变均会降低记忆的灵活性。本研究通过反转训练(Reverse Training)的范式对记忆灵活性进行检测如1C3所示。实验结果如图6所示健康对照组果蝇的行为指数是54.5，KS1-KS4组的行为值分别是42，49，54,和48。所有给抗生素组的果蝇均表现出与健康对照组无差异的行为值。2.5 KS4不影响果蝇的嗅觉功能
从学习能力测试发现，KS4(庆大霉素)会损伤果蝇的嗅觉学习能力，为了排除KS4不是通过损伤了果蝇的嗅觉系统功能而产生了嗅觉学习能力降低的结果，我们检测了KS4给药组对气味的分辨能力(方法如1.4所述)。结果显示相比于对照组，KS4并不影响果蝇对OCT和MCH气味的辨别能力(图7)，因此可以确定KS4造成的学习功能损伤有由于学习相关分子机制改变导致的。2.6 KS4损伤学习能力，KS1促进记忆维持的分子机理研究
蛋白激酶C (the protein kinase C, PKC)在跨膜信号传导中发挥着极为重要的作用，因此被认为“记忆激酶”。诸多证据都表明它参与记忆的获取和维持，降低PKC的磷酸化水平会导致学习能力损伤，而增强PKC磷酸化水平能够促进提高学习能力和记忆维持。行为实验发现KS4会损伤果蝇学习能力，因此通过蛋白印记检测KS4给药后果蝇大脑中总PKC和PKC磷酸化水平的变化，结果发现KS4给药24小时之后，果蝇大脑中PKC蛋白磷酸化水平显著下降(图8代表性生化结果，图9为统计结果)，但KS4不改变总PKC的含量，因此说明KS4可能通过产生降低PKC磷酸化水平导致学习能力下降。我们还检测了KS1给药24小时之后对果蝇的PKC活性的影响，结果发现KS1不影响PKC磷酸化水平和总PKC含量(图9)，由此得出KS1增强果蝇一小时记忆不通过PKC分子通路。有报道发现小G蛋白Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1)参与记忆遗忘调控，Rac1-GTP是Rac1的激活态，持续激活Rac1会促进记忆的遗忘，而抑制Rac1活性能抑制遗忘。我们检测了KS1和KS4在给予果蝇24小时之后，果蝇大脑中Rac1活性的改变，结果发现KS1和KS4均不影响影响Rac1激活态和总Rac1的含量(图8代表性生化结果，图10为统计结果)。3 结语
本研究利用果蝇模型，探索了四种不同抑菌机制的抗生素对果蝇嗅觉学习能力，记忆能力和认知灵活性的影响。通过果蝇行为实验和生化实验实验，我们发现：（1）过量及长时间摄入抗生素对寿命有一定的损伤，但我们意外发现利福平(KS2)在寿命实验中，能起到一定的寿命延长的作用(图1和图2)，有研究认为利福平有保护神经元的功能。（2）低剂量庆大霉素会通过抑制PKC磷酸化导致学习能力下降。在小鼠实验中发现庆大霉素会导致小鼠下丘核中的神经营养因子表达量显著性降低。（3）低剂量青霉素钾能促进果蝇1小时记忆的维持，生化实验证明其增强记忆维持功能不是通过提高PKC磷酸化及抑制遗忘分子Rac激活，而是通过其他分子通路。近年来，越来越多的研究发现肠道菌群会参与认知功能的调节，抗生素会通过改变肠道菌群的种类和数量影响大脑神经生长因子，本研究结合果蝇行为学对四种常用抗生素对认知功能的影响进行了探索，并对其作用机理进行了初步探索。
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