《全球癌症报告 2014 》显示，中国新增和死亡病例世界第一，每年约 250 万人死于癌症（肝癌），占世界肝癌总死亡人数的 51%。由肝纤维化引起各种病因的慢性肝病导致患者中的 25%～ 40%最终恶化为肝硬化乃至肝癌。肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是指由各种致病因子所致肝内结缔组织中肝星状细胞(HSC)增生导致肝内细胞外基质(ECM)过度沉淀的病理过程。肝纤维化细胞的特点：具有增殖性、纤维原性、可收缩性的肌成纤维样细胞。本实验室前期研究证明肝纤维化的进程是可逆的，但抗肝纤维化的作用机理未知。本实验旨在研究扶正化瘀胶囊抗肝纤维化的作用机理，为后续课题组对抗肝纤维化作用机理研究提供一定的依据。
1 实验材料
1.1 受试药物及其配制方法
扶正化瘀胶囊：0.3g/粒，国药准字Z20020073，批号：170109，上海黄海制药有限责任公司。临用前称取扶正化瘀药物粉末0.2925g溶于10ml温水中即得。30%CCL4：CCL4溶液与食用油按照3:7的比例混匀。
秋水仙碱：0.5mg/粒，国药准字H20113208，批号：20161004，广东彼迪药业有限公司生产。临用前称取0.2mg溶于10ml纯水中，即得。
0.9 %氯化钠注射液：国药准字H20043320，批号：161224510，武汉福星生物药业有限公司生产。
1.2 实验动物
SPF级KM小鼠，雄性，共96只，体重18～20克，由武汉生物制品研究所有限责任公司提供，实验动物生产合格证号：SCXK（鄂）2012-0013。1.3 实验动物饲养管理环境
实验动物饲养SPF级环境，实验动物使用许可证：SYXK（鄂）2014-0009。自由饮用净化水，光照为12h明暗交替，温度为22～24℃，相对湿度50～70%。2 仪器与试剂
2.1 试剂
10%中性甲醛、四氯化碳均购买于国药集团化学试剂有限公司；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；食用油为金龙鱼食用油。2.2 仪器
石蜡切片机（Finesse E+，赛默飞世尔）；烤片机（High Capacity Dryer，赛默飞世尔）；包埋机（Histo Star，赛默飞世尔）；包埋盒打号机（Printmate 150，赛默飞世尔）；脱水机（Excelsior ES，赛默飞世尔）；动物秤（DS-671，上海金山亭衡衡器有限公司）；倒置荧光显微镜（BX53，OLYMPUS）；全自动生化分析仪（AU400，OLYMPUS）；台式低温高速离心机（3K15，德国SIGMA）。3 实验方法
3.1 动物分组与给药
KM小鼠适应环境5天后，按随机数表法随机分为空白对照组、模型对照组、扶正化瘀给药组和秋水仙碱给药组。除空白对照组给予0.9%氯化钠注射液外，剩余小鼠均给予30%CCL4腹腔注射，造模与治疗同时进行，灌胃体积20ml/kg，每周2次，共计4周。实验期满，所有小鼠禁食不禁水12h，取血，分离血清并采集组织样本。
3.2 一般情况观察
观察小鼠进食、存活、活动状态、毛色光泽度、排便等情况。3.3 病理形态观察
苏木精-伊红染色（HE），观察小鼠肝纤维化的程度，倒置荧光显微镜观察肝组织切片的超微结构。从肝左叶中部切取厚度约2mm的肝组织，用10%中性甲醛固定。将固定好的肝组织依次放置于脱水机按照“70%乙醇3h，80%乙醇 2h，90%乙醇 2h，95%乙醇 2h，100%无水乙醇（Ⅰ）30min,100%无水乙醇（Ⅱ）30min，二甲苯（Ⅰ）20min，二甲苯（Ⅱ）20min”的设定程序进行脱水，然后依次置于包埋机、包埋打号机中包埋染色、打号，于烤片机中烘干后用切片机切制厚度为5μm的切片。用Progres CapturePro2.8.8显微图像处理系统观察并收集图片，比较各组肝脏组织形态变化。
3.4 肝功能生化检测
小鼠取血后室温静置1h，12000r/min，离心10min，分离血清，用全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）碱性磷酸酶（ALP）。4 统计学处理
计量数据均以均数±标准差表示，用SPSS16.0进行统计学分析，不同组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05时，差异具有统计学意义。5 结果
5.1 一般情况观察
空白对照组，小鼠活动正常，毛发有光泽，饮食量正常；模型组，小鼠活动减少，精神萎靡，毛发无光泽，尿液黄色，大便稀溏，有腹泻，饮食量减少，小鼠喜欢缩在角落里；扶正化瘀给药组与秋水仙碱给药组小鼠活动程度、饮食量和毛发光泽程度均好于模型组；秋水仙碱给药组小鼠给药期间发生过小鼠厮打现象。实验期间，空白对照组小鼠无死亡，死亡率0%；模型对照组小鼠死亡9只，死亡率37.5%；扶正化瘀给药组小鼠死亡2只，死亡率8.3%；秋水仙碱给药组小鼠死亡9只，死亡率37.5%。为方便统计学统计，各组均取10只小鼠进行相关指标的检测。5.2 肝病理形态观察
空白对照组肝小叶结构清晰完整，肝细胞多呈单核，以中央静脉为中心呈放射状排列；肝纤维化模型组小鼠肝小叶有大量的炎性细胞；扶正化瘀给药组和秋水仙碱给药组与肝纤维化模型组相比，其纤维化程度明显减轻，炎性细胞侵润程度减小，与空白对照组相比，其肝纤维化程度明显增强，表现为肝细胞排列紊乱，细胞和有炎性细胞侵润；扶正化瘀给药组与秋水仙碱给药组肝纤维化程度相比较，秋水仙碱给药组纤维化程度明显减轻，表现为肝小叶结构轻度紊乱、排列恢复。
图1 HE染色（×40）
5.3 血清生化学指标检测
血清生化学结果显示（表1），肝纤维化模型组（CCL4组）较空白对照组ALT、AST、ALP值显著升高（P＜0.05）；扶正化瘀给药组和秋水仙碱给药组与肝纤维化模型组相比ALT、AST、ALP值明显下降，存在显著差异（P＜0.05）；扶正化瘀给药组与秋水仙碱给药组的ALT、AST、ALP值相比虽然低但不存在显著差异，无统计学意义（P＞0.05）（表2）。
表1 血清生化学指标
6 讨论
本实验采用30%CCL4制备小鼠肝纤维化模型， CCL4模型是一种典型的制备肝纤维化模型方法，具有耗时短的特点。造模成功后可见肝细胞以及血清生化指标发生显著变化，ALT、AST、ALP是用于反映肝功能损伤或健康程度的基本指标，大量文献中使用ALT、AST、ALP的频率远高于其他指标。有文献将体重或肝指数作为检测指标，我们在实验中发现，CCL4与油混用后，经过腹腔注射、皮下注射和灌胃后，油的成分均有滞留在动物体内的现象，使动物体重不同程度的增加。因此，我们认为将体重或肝指数作为检测指测指标不具有研究意义。
有文献报道小鼠肝纤维化模型制备后，存在一定的自愈倾向。为了验证这一结论，我们额外增加了一项预实验，另取18只KM小鼠，分为空白对照组、模型对照组和自愈组，空白对照组给0.9%氯化钠，模型对照组给30%CCL4，除自愈组在第4周末次给药后保留外，剩余两组全部处死，取肝组织固定保存，自愈组每继续经过1周处死一只，观察肝组织形态变化。发现在制备模型成功后，肝纤维化小鼠存在极弱的自愈能力，小鼠的肝组织形态几乎无变化。
秋水仙碱作为西药中的合成药物，作用见效快，但死亡率高，不利于肝纤维化治疗的用药安全。中药是以中医理论为指导，按中医治疗原则使用的货真质优的药材，包括中药材、中药饮片和中成药。随着中医、针灸在西方世界的发展,中药也受到了青睐。相对于毒副作用高的西药，中药毒副作用小、开发潜力巨大，但其作用机理的阐明仍需继续研究。
